RNA干扰开辟一个话题，请欢迎大家参加 | 蓝月 | RNA干扰是新发现的一种基因阻断技术，可用于基因功能、抗病毒及肿瘤防治等研究，有广阔的前景与应用潜力，被评为2002年十大发现之首。希望大家积极参与。
是一种基因特异关闭现象，记得过去的《科学》也介绍过。我援引生物谷的一些讨论~2004-4-13 19:38:25 |
|
| 回复：蓝月 | lyzxf：RNA干扰是指由siRNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象，其本质是siRNA与互补的mRNA特异结合，通过一系列机制，使mRNA降解，从而阻止mRNA的翻译。
RNAi的发现：
早在1990年，Jorgensen等在研究如何增加矮牵牛花的颜色时，观察到一种无法解释的现象：通过添加过量色素基因拷贝来增加植物花的着色，结果事与愿违，不但花未着色，反而部分花变为白色。进一步的试验表明，这些导入的基因不仅不表达，反而使植物本身的基因表达也受到了抑制，即所谓的共抑制（cosuppression）。1995年康乃尔大学的Guo博士在研究秀丽线虫（C.elegans）时，发现正义与反义RNA均有抑制作用。1998年Fire解释了Guo博士遇到的现象，认为其使用的反义RNA和正义RNA中混入了双链RNA，后经证实dsRNA的抑制作用远强于反义RNA，该小组称此现象为RNAi（RNA interference）。
Although initially recognized as a handy tool to reduce gene expression,
RNA silencing, triggered by double-stranded RNA molecules, is now recognized as a
mechanism for cellular protection and cleansing: It defends the genome against molecularparasites such as viruses and transposons, while removing abundant but aberrantnonfunctional messengerRNAs. The underlying mechanisms in distinct gene silencingphenomena in different genetic systems, such as cosuppression in plants and RNAi inanimals, are very similar. There are common RNA intermediates, and similar genesare required in RNA silencing pathways in protozoa, plants, fungi, and animals,
推荐3篇文章
1. Jorgensen RA,Cluster PD,English J,et al.Plant Mol Biol,1990;93(5:957~973)
2. Guo S,et al.Cell,1995;81:611~620
3. Fire A,et al.Nature,1998;391:806~811
2004-4-13 19:39:59 |
|
| 回复：蓝月 | 仍然是楼上那位的
siRNA实验成功要点之一
1.对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列
2.选择低GC含量的siRNA
3.纯化体外转录siRNA
4.避免RNA酶污染
5.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
siRNA实验成功要点之二
6.避免适用抗生素
7.选择好的转染试剂转染siRNA
8.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件
9.通过阴性对照siRNA排除非特异性影响
10.通过标记siRNA来优化实验2004-4-13 19:42:35 |
|
| 回复：hbchendl | 去年学分子生物学时写了个综述。帖上来凑个热闹。
RNA干扰现象及相关研究
摘要：RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene silencing, PTGS) 。导入细胞中的dsRNA能使其对应的mRNA降解，从而抑制了相关基因的表达。这一现象有望成为今后分析基因功能的有力工具。有着广泛的研究和应用前景。
关健词：RNAi，dsRNA，RNA干扰，基因沉默
RNA干扰现象自1995年发现以来，受到广泛的重视和大量深入的研究。已经发现在许多生物体内都存在RNA干扰现象。RNA干扰的机制正在逐步被揭示。RNA干扰的的应用也显现出广泛的前景。
1. RNAi的发现及发展
RNAi现象是1995年Guo和Kemphues发现的 [ ]，当时他们的本意是想利用反义RNA技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫(C. elegans)中的par-1基因的表达。同时作为对照也注射了正义RNA。但结果却是对照组与实验组都起了作用。
1998年Fire等对此进行研究后发现[ ]，给秀丽新小杆线虫注射与其机体同源基因(靶基因)的双链RNA才能阻断靶基因的表达。而以前所观察到的反义RNA 对相关基因的阻断现象实际上是反义RNA中的少量双链RNA的作用结果。提纯的正义RNA对基因没有阻断作用，反义RNA对基因只有很微弱的阻断作用。只有提纯的双链RNA才有高效、特异的基因阻断作用。由此发现了RNA干扰现象并命名为RNAi(RNA interference)。
随后的研究发现在许多生物中存在RNAi [ ]，包括植物、果蝇、锥虫、涡虫、线虫等。到1999年Tuschl等在哺乳动物中发现RNAi[ ]，并发现dsRNA在细胞内首先被降解成21-25nt的小片段(siRNA)，然后相应的RNA也在与其同源的区段内，按照同样的间隔被降解成21-25nt的小片段。这与植物中基因表达的共抑制(co-suppression)现象和真菌中的基因压制 (quelling)现象非常相似，现已普遍认为这三种基因沉默现象之间很可能存在相同的分子机制。Sayda等[ ]则发现哺乳动物细胞(如人胚肾细胞、Hela细胞等)同样存在RNAi，并且发现具有对称性3’突出2nt的约21nt siRNAs 双链复合物(small interfering RNAs duplex )可以诱导RNAi，但较长的dsRNA由于可以诱发细胞内干扰素系统，从而表现出广泛的非特异性阻抑效应。
2. 对RNAi作用机制的研究
自RNAi现象报道以来，许多科学家对此进行了大量的研究，他们主要以线虫、果蝇为研究对象，相继提出了RNAi的一些作用机制模型。虽然RNAi的作用机制还未完全弄清楚，但目前已经通过实验证明了两种基本作用模式：
2.1. Dicer 和Slicer依赖模式
Hammond [ ]用果蝇胚胎细胞及培养细胞S2作为研究对象发现：长dsRNA被导入细胞后，首先被剪切为长度21-25nt的双链小片段，(siRNA)，这是由一种特异性双链RNA核酸内切酶Dicer 催化的。生成的siRNA与另一种蛋白核酸酶Slicer结合，最终生成一种有活性的RNA 诱导的基因沉默复合物(RNA induced silencing xomplex,RISC)，RISC识别与siRNA具有同源互补序列的靶RNA，并对靶RNA进行剪切，产生了RNAi作用。
2.2. 随机降解PCR模式
这种模式的作用机制与一种名叫RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases, RdRPs)有关。RdRPs不仅可以扩增dsRNA，同时也可以扩增siRNA。具体过程为：RdRP利用siRNA链作为引物，以靶RNA作为模板来合成新的双链RNA。合成的双链RNA分子再次被Dicer水解。被Dicer水解释放出的新的siRNA又可以作为引物指导新一轮dsRNA的合成，降解。在果蝇、真菌、线虫等细胞内均能检测到这种RdRP的活性[ ]。通过这种机制产生的RNAi在各类线虫体内均存在，而且可以遗传几代以上。
3. RNAi实验技术的研究进展
在最初进行RNAi研究时采用的方法是体外化学合成法，即在体外合成dsRNA导入宿主细胞，然后检测靶基因抑制效率。进行功能研究。或者采用体外转录法，采用T7RNA聚合酶，以先合成的DNA链为模板反转录合成dsRNA，进行下一步工作。这两种方法的共同缺点是dsRNA转入宿主细胞效率以及其在宿主细胞中的稳定性及RNAi作用效率均不确定。
最近Patrick报导了体内载体合成法[ ][ ]。是利用载体在细胞体内稳定地表达siRNA，从而抑制哺乳动物细胞靶基因表达的方法。其基本思路为：细胞内存在RNA polymerase III，它可以识别U6启动子，从而使启动子后的基因转录成RNA。当模板连续出现3-5个”T”碱基时，转录就会终止。根据这一机制，可以设计一种能表达RNA的质粒，其组成包括四部分：①常用质粒的基本序列；② U6启动子，位于克隆位点的上游； ③克隆位点；④RNAi模板序列(DNA)。这部分序列具有如下特点：含RNAi序列，对哺乳动物而言，通常为21-23个核苷酸；发卡结构球状部分，通常有4-7个核苷酸；靶序列的反向互补序列；3-5个核苷酸”T”。将具有如上结构的质粒导入细胞内，体内的RNA polymerase III就可以合成一条RNA链，这条RNA链可以通过两端的21个左右的核苷酸反向互补特性而形成发卡样双链结构，从而起到基因抑制作用。这种技术操作简便，成本低，DNA质粒相对容易导入细胞内，而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定，对靶基因的表达抑制效率高，便于进行较长时间的基因功能研究。
Cythla等后来对载体进行了改进[ ]。在上述载体的克隆位点上游加入了人U6RNA的前27个核苷酸，在克隆位点下游又加上一段能形成发卡样结构的核苷酸序列及转录终止信号poly(U)。据报道，这种改进的质粒大大增加了siRNA的转录效率及稳定性，同时对靶抑制作用也大增加，因而被认为是迄今最完善的质粒载体。
4. RNAi的应用
利用RNAi来阻断特定基因的表达，给我们提供了一个非常有用的研究基因，改变基因功能的工具。还可以在基因水平上进行疾病的治疗，如抑制病毒、治疗肿瘤疾病等。相关的研究已经开始进行。最近美国科学家就正在尝试用RNAi技术进行SARS冠状病毒的治疗。
4.1. 抗病毒
用与目标病毒RNA同源的双链RNA对病毒基因的表达进行抑制是RNAi抗病毒作用的原理。Lindenbach [ ]于2002年5月采用21个核苷酸双链DNA形成双链RNA，加入到感染艾滋病病毒的细胞中，在24小时后减少艾滋病病毒基因表达90%以上。Novina[ ]则于当年7月用RNAi技术实现了HIV-1病毒的阻抑。McCaffery[ ]等人将合成的双链RNA和通过载体将双链DNA形成小发夹状的双链RNA直接注入鼠的肝脏，并将肝炎C病毒与标志基因相连后感染鼠肝脏，这种双链RNA或双链发夹状RNA对标志基因的表达抑制分别达到81%和92.8%，表明这两种双链RNA 均可明显地抑制成体鼠肝脏内导入的肝炎C病毒基因的表达。
4.2. 基因治疗及抗肿瘤
用RNAi技术关闭肿瘤相关基因的表达。Wildaa [ ]等用这项技术成功地杀死了带有BCR/ABL的白血病细胞。用这项技术杀死其他癌细胞的试验也有一些获得成功。当然这项技术应用于临床还需要进一步的研究和试验。
4.3. 基因功能的研究
RNAi技术不公可抑制体外特定基因的表达，而且也可抑制体内特定基因的表达。这样在研究特定基因功能时就能通过关闭其功能表达的方法来分析确定其功能。比传统方法省时省力。将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能。根据所选用序列的不同，可将其分为编码区RNAi和启动子区RNAi技术。
对编码区RNAi技术，早期是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中，关闭目的基因的表达。缺点是不能遗传。Tavernarakis[ ]对此进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成具发夹环结构的dsRNA，从而产生RNAi，使目的基因沉默。Chuang[ ]使用此技术研究了植物拟南芥的AG, CLV3, API, PAN四个开花相关基因。结果表明使用RNAi技术可以产生功能丧失或降低突变体，其表型与以前通过其他方法鉴定的突变体类似。
对启动子区RNAi技术，Mette[ ]等证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。
由于多基因家庭的各成员之间高度同源，因而使用编码区RNAi技术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家庭内的启动子序列通常比编码区变化大，采用启动子区RNAi技术有望将多基因家庭的各个成员区分开来研究。这样综合编码区RNAi技术和启动子区RNAi技术的信息即可更全面地了解多基因家庭的各成员的功能。
5. 结语
RNAi是正常的发育和机体抵御外源性病毒入侵的重要机制。对RNAi机制的研究可以帮助我们了解生理、病理机制；对RNAi实验技术的研究发展则为基因或蛋白功能的研究提供了重要的手段。也为基因治疗肿瘤和病毒感染疾病提供了一个新的方法。
2004-5-13 21:14:12 |
|
| 回复：蜻蜓 | 站长是学生物的，楼上对生物也有这么深刻的见解实在佩服。
对于我这个外行来说，只能是来长学问的2004-5-14 12:32:21 |
|
| 回复：蓝月 | 很专业呢~
代注：文章中“[ ]”本身是引用文献的出处角标
hbchendl:
你也是学生物的吧~
大几了啊还是研究生？~
[此贴子已经被作者于2004-5-14 18:57:20编辑过]
2004-5-14 18:55:55 |
|
| 回复：蜻蜓 | | hbchendl是学物理的，是大学教师 2004-5-15 18:08:15 |
|
| 回复：admin | 呵呵，我原来以为是生物专业的学生呢~
呵呵，失敬失敬~2004-5-15 20:03:51 |
|
| 回复：hbchendl | | 楼上倒也没说错。我开头就说过，是去年学分子生物学时作的作业嘛。 2004-5-18 20:19:28 |
|
|
|
说明 |
| 本部分是由科网早期论坛静态生成。有任何问题请到新论坛发表意见。本版块已不设互动功能。 |
|
论坛入口 |
|
|
|
|
论坛卡片 |
| 2003年到2004年间，蜻蜓出任科学论坛斑竹，尽职尽责。论坛得到了一些网友的支持，虽然帖子数量不多，但质量还都不错。在此向这些网友道谢了！ |
|
观点声明 |
| 论坛中所有帖子的观点仅代表作者其人在当时的时间的个人观点。我们注意到这里有些观点，如fangwu朋友的，似乎存在很大的问题，但为保留论坛原数据仍保留。请读者擦亮眼睛。 |
|
Google提供的搜索 |
|
|
|
|
